Este Museo debe su nombre al Hospital de Santa Cruz construido en un solar que cedió la Reina Isabel La Católica. Según lo dispuesto por El Cardenal Mendoza en su testamento, con sus bienes habría de levantarse un hospital donde poder sanar a los enfermos y sobretodo recoger a niños abandonados y sin hogar. El diseño del edificio plasma el interés por los principios de higiene y salubridad de la época, contando con gran ventilación y aprovechando la luz del sol.
El primer proyecto fue obra de Enrique Egas, y en sólo diez años ya se habría edificado el hospital y el primer claustro. La obra fue continuada por el arquitecto real de Carlos V, Alonso de Covarrubias, quien intervino en la construcción del patio principal, la fachada y la magnífica escalera. El conjunto arquitectónico es una brillante mezcla de gótico, hispano-flamenco final y estilo renacentista con decoraciones platerescas. Desamortizado desde 1836, tuvo diferentes usos hasta su inauguración como museo en 1930. En este Museo se exhibían los fondos del antiguo Museo Arqueológico Provincial. Actualmente el museo recoge una gran variedad de restos arqueológicos y muestras del arte local. Las piezas que se exponen van desde el Neolítico hasta el Renacimiento, configurando un amplio catálogo desde instrumentos líticos prehistóricos a obras pictóricas de época barroca. Entre la colección arqueológica destaca una cabeza de elefante de grandes dimensiones de época paleolítica, un gran mosaico romano encontrado en un villa de la ciudad, y un brocal de pozo en mármol, datado del siglo XI, hallado en las inmediaciones de la actual catedral. De la colección pictórica destacan las obras del Greco, como la Verónica de con la Santa Faz o la Anunciación de Oballe, terminada un año antes de su muerte. Se pueden contemplar también pinturas de Luca Giordano, José de Ribera y una obra escultórica de Berruguete.
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